一、單細胞核提取的方法

1. Ficoll分層液法

Ficoll分層液法是一種單次密度梯度離心分離法.聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll）,分子量為40kD,具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點.高濃度的Ficoll溶液粘性高,易使細胞聚集,故通常使用60g/L的低濃度溶液,密度為1.020,添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度.國外常用商品Isopaque或Hypaque,故又稱Ficoll-Hypaque分層液,將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液.分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液效果較好，因為人的紅細胞密度1.093粒細胞密度為1.092，單個核細胞在1.076～1.090之間.而不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088,馬為1.090.分離時先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當稀釋后,輕輕疊加在分層液上面,使兩者形成一個清晰的界面.水平式離心后,離心管中會出現幾個不同層次的液體和細胞帶.紅細胞和粒細胞密度大于分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底.血小板則因密度小而懸浮于血漿中,唯有與分層液密度相當的單個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀,吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸.本法分離單個核細胞純度可達95％,淋巴細胞約占90％～95％,細胞獲得率可達80％以上,其高低與室溫有關,超過25℃時會影響細胞獲得率.

2.Percoll分層液法

這是一種連續密度梯度離心分離法.Percoll是一種經聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒,對細胞無毒性.利用Percoll液經高速離心后形成一個連續密度梯度的原理,將密度不等的細胞分離純化.用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強度的磷酸緩沖液均勻混合,高速離心后,使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續密度梯度,再將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上,低速離心后,便得四個細胞層.表層為死細胞殘片和血小板,底層為粒細胞和紅細胞,中間有兩層,上層富含單個核細胞(75％),下層富含淋巴細胞(98％).該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法,但操作流程較長,手續較多

二、使用密度梯度離心法提取細胞核

操作步驟

1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。

2．將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。

3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標記，自然干燥。

4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm，離心15分鐘；

(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；

(2)同時涂一張上清液片②做好標記，自然干燥；

(3)余下的沉淀物進行下一步驟。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。

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