為了克服單細胞免疫印跡方法中的信號背景增強這一瓶頸，近，有報道稱2-芳基-5-羧基四唑-賴氨酸的類似物是一種良好的光親和標記材料，可用于蛋白質靶標的原位固定和特異性位點結合。在這些類似物中，（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5甲酰胺（mPyTC）與傳統(tǒng)的光活化基團（包括芳基酮，芳基疊氮化物和二疊氮基）相比，在選擇性蛋白質靶標標記中顯示出更強的特異性。

受這些工作的啟發(fā)，作者在此提出了一種合適的聚丙烯酰胺交聯(lián)四唑基團，作為一種高效率、高選擇性的光活性水凝膠用于凝膠內(nèi)蛋白質的光固定化。

MAP-mPyTC的紫外可見光譜在346nm處呈現(xiàn)一個峰值，是其的紫外激發(fā)波長。以此，用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的牛血清白蛋白（BSA）評估了MMP凝膠固定光誘導蛋白性能。圖2c表明MMP在正常的電泳條件下，凝膠在不暴露于紫外線時仍保持穩(wěn)定性。圖2d表明只需要60s的紫外線照射MMP凝膠就能光固定蛋白質。此外，MMP凝膠優(yōu)于先前報道BPMAC約85％的光捕獲效率。

作者進一步研究了固定光誘導蛋白的分子范圍，并通過結合各種分子量（BSA，卵清蛋白[OVA]，胰蛋白酶抑制劑[TI]和溶菌酶）的蛋白質靶標而擴大了靶標庫。在60s內(nèi)成功捕獲了所有蛋白質靶標，并且在分子量較小的情況下，捕獲動力學遵循相同的指數(shù)模式（圖2e）。在條件下（紫外線激發(fā)時間：60s，MAP-mPyTC濃度：0.6mM），作者觀察到蛋白質靶標明顯固定在MMP凝膠上，效率分別為92.77±1.35％，分別為91.16±3.91％，86.45±2.81％和82.36±4.44％。

2、MMP凝膠的免疫印跡分離性能驗證

接下來，對MMP凝膠的性能進行了測試。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示凍干光敏感凝膠中清晰的多孔結構（圖3a，左）。用Image J測量孔徑，結果表明MMP凝膠的孔徑與普通凝膠PA凝膠相似，而BP-PA凝膠的孔徑較小（圖3a，右）。然后，基于這一理論作者研究了MMP凝膠的分離性能，結果表明，在電泳過程中總丙烯酰胺濃度的變化（%T，凝膠孔徑的調整）要優(yōu)于篩選蛋白質靶大小。與PA和BP-PA凝膠電泳相似，觀察到MMP凝膠電泳具有較好的分離分辨率（圖3b）。總的來說，在電泳30s后MMP凝膠顯示了五種物種的良好分離。

凝膠內(nèi)免疫檢測的另一個瓶頸是水凝膠自熒光干擾，這是用于檢測靈敏度低的原位免疫印跡方法一個主要的瓶頸。為了檢測自體熒光對檢測靈敏度的影響，以牛血清白蛋白作為驗證靶，用抗牛血清白蛋白一抗和相應的二抗在凝膠中進行檢測。從熒光圖像中觀察到，BP-PA凝膠中的背景熒光信號明顯較高（圖3d）。而分析物MMP中條帶信號較強（圖3e），信噪比顯著提高（圖3f）。此外，選擇性更高的官能團顯著避免了非特異性的結合。

3、MMP凝膠scWB的性能測試

作者采用常規(guī)流程（圖4a）來確定scWB的穩(wěn)定性，同時使用MMP凝膠分析了GES-1-GFP/GES-1細胞系和MGC803-GFP/MGC803細胞系的生物樣本（圖4b，c）。結果顯示GES-1-GFP/MGC803-GFP組和陰性對照組與常規(guī)免疫熒光成像和流式細胞術的結果相似（圖4d），紫外線對光捕獲靶抗原無不良影響，與其他mPyTC衍生物介導的蛋白質研究相一致。

P-糖蛋白（P-gp）是ATP結合轉運蛋白超家族的成員外排蛋白，與化療耐藥有關。研究P-gp表達譜的細胞間差異有助于闡明耐藥的潛在機制。為進一步驗證所制備的MMP凝膠的對目標蛋白的檢測能力，利用誘導劑（利福平）或抑制劑（維拉帕米）處理GES-1/MGC803細胞系，通過scWB對P-gp進行檢測其在細胞間的差異性。

Q-P-gp在MGC803腫瘤細胞中的表達高于GES-1正常胃粘膜上皮細胞（圖4e）。利福平誘導組和維拉帕米抑制組的P-gp在GES-1細胞中的表達有顯著差異。結果表明，MGC803腫瘤細胞比正常GES-1細胞具有更強的耐藥性，P-gp在GES-1細胞中的表達更易受到化學物質的影響。基于MMP的scWB顯示的組間差異在傳統(tǒng)的免疫印跡分析中是觀察不到的。值得注意的是，在BP-PA凝膠中，維拉帕米治療組P-gp蛋白的熒光信號大多被光敏凝膠的背景熒光所掩蓋，但在MMP凝膠中卻可以清楚地觀察到（圖4f）。這些結果表明，作者提出的光敏感凝膠在單細胞分辨率下描繪了低豐度蛋白質的表達水平，可以提供以往方法無法獲得的細胞間特異性。