文獻解讀|膽固醇通過改變蛋白冠的組成來調(diào)節(jié)對納米顆粒的生理反應(yīng)

更新時間：2024-04-02

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文獻解讀

文獻背景

盡管納米粒子(NPs)在生物成像、藥物輸送、疫苗和癌癥免疫治療等方面具有潛在廣泛的應(yīng)用前景，但由于其在臨床試驗中的表現(xiàn)效果不甚理想，已在市場上獲得批準的納米藥物數(shù)量仍低于預(yù)期。這種巨大差距的部分原因是缺乏對患者體內(nèi)的納米生物層面的了解。當(dāng)納米藥物進入人體時，不可避免地會與體液中的生物分子相互作用，在其表面形成 “蛋白冠"(PC)。越來越多的證據(jù)表明，PC對納米藥物在體內(nèi)的生物分布、生物利用度和生物轉(zhuǎn)化具有重要影響。因此，了解PC的形成和生物學(xué)作用是納米藥物安全有效臨床應(yīng)用的重要一步。

PC的形成可能受到許多因素的影響，例如生物體液中納米顆粒和蛋白質(zhì)種類的理化性質(zhì)。PC的蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜為疾病的早期診斷、進展和預(yù)測提供線索。先前的研究表明，從不同供體獲得的人血漿樣本可以差異調(diào)節(jié)PC的成分，從而影響對NPs的生理反應(yīng)。因此，個性化PC的概念（指在患者或健康個體中定制生成的PC）被提出，用于開發(fā)精密納米醫(yī)學(xué)。然而，決定PC形成和納米藥物隨后體內(nèi)行為的關(guān)鍵因素仍然知之甚少。代謝物，尤其是脂質(zhì)，會吸附在NPs表面，但這種相互作用對PC形成的生物學(xué)意義尚不清楚。本文章探討代謝物如何驅(qū)動PC的形成并影響納米藥物的體內(nèi)命運，特別是在血清代謝物水平異常的相關(guān)疾病患者中。

基本信息

題目：Cholesterol modulates the physiological response to nanoparticles by changing the composition of protein corona

期刊：Nature Nanotechnology

IF：38.3

PMID: 37537273

DOI：10.1038/s41565-023-01455-7

通訊作者：徐承超，王繼剛

作者單位：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

索萊寶合作產(chǎn)品：

貨號	名稱
BC1980	總膽固醇含量檢測試劑盒

摘要

生物體液中的納米顆粒(NP)形成一層稱為蛋白冠的生物分子。蛋白冠已被證明可以決定NP的生物學(xué)特性和體內(nèi)命運，但代謝物（尤其是與疾病相關(guān)的小分子）是否以及如何調(diào)節(jié)蛋白冠并隨后影響納米粒子在體內(nèi)的命運尚不清楚。此研究報告膽固醇對蛋白冠產(chǎn)生的影響以及隨后的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇水平（如高膽固醇血癥）會通過改變蛋白質(zhì)與納米粒子的結(jié)合親和力，導(dǎo)致載脂蛋白富集和補體蛋白減少的蛋白冠。與正常蛋白冠相比，膽固醇介導(dǎo)的蛋白冠可以誘導(dǎo)巨噬細胞對納米顆粒產(chǎn)生更強的炎癥反應(yīng)，并通過增強脂蛋白受體的識別來促進肝細胞對納米顆粒的細胞攝取。體內(nèi)生物分布測定結(jié)果表明，與健康小鼠相比，高膽固醇血癥小鼠的納米顆粒更容易被遞送至肝臟、脾臟和大腦，而不太可能被遞送至肺部。研究結(jié)果表明，代謝組譜是影響納米藥物的目標(biāo)功效和安全性的未開發(fā)因素，這提供了一種通過利用與疾病相關(guān)的代謝物來開發(fā)個性化納米藥物的方法。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1、膽固醇對蛋白冠形成的影響

作為一種必需的代謝物，膽固醇在膜組織和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。膽固醇代謝失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，例如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。為研究膽固醇對NP上PC形成的影響，是否可能會導(dǎo)致納米藥物對高膽固醇血癥患者產(chǎn)生個體化效應(yīng)。本研究選擇了兩種有前途的納米材料——二氧化硅納米粒子(SNP)和金納米粒子，它們在納米醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。首先使用定義的系統(tǒng)測試了膽固醇在PC形成中的作用（圖1a）。將NP與補充膽固醇的胎牛血清(FBS)或正常FBS一起孵育，然后收集NP上形成的PC進行分析。電泳和蛋白質(zhì)定量結(jié)果均表明，過量的膽固醇會以劑量依賴性方式降低PC含量（圖1b、c和擴展數(shù)據(jù)圖1a-d）。使用脂質(zhì)體也進行了類似的觀察（補充圖1）。為了在更具臨床相關(guān)性的環(huán)境中證實該結(jié)果，收集了來自志愿者的三份具有不同膽固醇濃度(4.4mM、5.6mM和7.2mM)的人血清樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢（圖1d、e和擴展數(shù)據(jù)圖1e）。接下來，通過透射電子顯微鏡(TEM)直接觀察裸露的納米粒子和涂有來自正常FBS(Nor-PC)或含有高濃度(15.3mM)膽固醇的FBS(Cho-PC)的PC的納米粒子（圖1f）和冷凍TEM（擴展數(shù)據(jù)圖2a）。很明顯，膽固醇確實降低了納米顆粒的冠層厚度。對于AuNPs和SNPs的裸露的NPs、NPs-Nor-PC和NPs-Cho-PC的TEM尺寸和流體動力學(xué)直徑也支持了這一點（擴展數(shù)據(jù)圖2b-d）。

由于隨著膽固醇濃度的增加，更多的膽固醇被SNP吸收（擴展數(shù)據(jù)圖2e），接下來通過改變膽固醇蛋白或膽固醇-NP相互作用來研究膽固醇對PC形成的影響。為此，進行了競爭實驗（擴展數(shù)據(jù)圖3a）。一方面，用膽固醇對納米粒子進行預(yù)處理，明顯減少了納米粒子表面吸附的蛋白質(zhì)數(shù)量；另一方面，高濃度膽固醇對PC形成的抑制作用通過用正常FBS中的蛋白質(zhì)預(yù)先占據(jù)NP而部分逆轉(zhuǎn)（圖1g，h）。因此，膽固醇-蛋白質(zhì)和膽固醇-納米顆粒相互作用都會影響納米生物界面中納米顆粒上蛋白質(zhì)的吸附。綜上所述，血清中的膽固醇是個性化PC形成的關(guān)鍵因素。

圖1|剖析膽固醇介導(dǎo)的PC形成

圖2|膽固醇調(diào)節(jié)PC的

蛋白質(zhì)組指紋圖譜

2、膽固醇調(diào)節(jié)蛋白冠的蛋白質(zhì)組指紋圖譜

為了獲得有關(guān)在胎牛血清中的SNP上形成的Nor-PC和Cho-PC的蛋白質(zhì)指紋圖譜的信息，進行了蛋白質(zhì)組分析（擴展數(shù)據(jù)圖3b）。結(jié)果表明，血清中的高水平膽固醇可以豐富載脂蛋白并減少NP上PC中的補體蛋白。

圖3|Cho-PC引發(fā)巨噬細胞

對NP更強的免疫反應(yīng)

PC的形成遵循“Vroman效應(yīng)"，即早期吸附的高豐度蛋白質(zhì)將被具有更高親和力的蛋白質(zhì)競爭性取代。接下來通過微尺度熱泳(MST)測量了這兩種蛋白與有或沒有膽固醇的SNP的結(jié)合親和力（圖2e）。表明，膽固醇可以通過差異調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白的親和力來重塑PC中的蛋白質(zhì)豐度。然后，進行了分子動力學(xué)模擬，以探索在存在和不存在膽固醇的情況下APOE和SNP之間的相互作用。結(jié)果表明，膽固醇-蛋白質(zhì)和膽固醇-NP相互作用有助于重塑Cho-PC組成的結(jié)論。

3、膽固醇-蛋白冠增加巨噬細胞對納米顆粒的免疫反應(yīng)

由于PC已被廣泛認為是NP的生物學(xué)特性，于是探討了Cho-PC對NP體外和體內(nèi)行為的影響。由于游離膽固醇和膽固醇預(yù)處理的NP都不能增加免疫反應(yīng)（圖3e，f），因此對NP的免疫反應(yīng)增加主要受到PC中膽固醇介導(dǎo)的變化的影響。然后，進行蛋白質(zhì)組分析，以鑒定與SNPs-Cho-PC和SNPs-Nor-PC孵育后巨噬細胞中差異表達的蛋白質(zhì)。與對照組相比，SNPs-Nor-PC治療組中鑒定出788個下調(diào)蛋白和785個上調(diào)蛋白（擴展數(shù)據(jù)圖7c）。盡管Nor-PC和Cho-PC都激活了巨噬細胞的免疫反應(yīng)，但Cho-PC引發(fā)了更強的反應(yīng)。通過炎癥相關(guān)通路的基因集變異分析(GSVA)評分，發(fā)現(xiàn)了一致的變化（圖3i）。這些結(jié)果表明，Cho-PC可能比Nor-PC更大程度地增加免疫系統(tǒng)響應(yīng)NP的激活風(fēng)險。

4、Cho-PC增強肝細胞對NP的細胞攝取

由于細胞攝取對于納米藥物的藥代動力學(xué)和靶向效率至關(guān)重要，并且藥物通常由肝細胞代謝，進一步研究Cho-PC是否可能影響肝細胞中NP的細胞內(nèi)化。使用HepG2細胞作為人肝細胞的體外模型，首先評估了AuNP（擴展數(shù)據(jù)圖8a）和SNP（擴展數(shù)據(jù)圖8b）的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞內(nèi)有更多的AuNPs-Cho-PC積累（圖4f，g）。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析發(fā)現(xiàn)，Cho-PC組中檢測到的Au多于Nor-PC組（圖4h）。由于向培養(yǎng)基中添加膽固醇會抑制NP內(nèi)化（擴展數(shù)據(jù)圖8d-g），因此細胞對NP的攝取增強可能應(yīng)歸因于膽固醇誘導(dǎo)的Cho-PC的特定蛋白質(zhì)成分，而不是膽固醇本身。

為了進一步研究Cho-PC誘導(dǎo)的NPs增強細胞攝取所需的關(guān)鍵因素，檢測在不同類型的內(nèi)吞作用抑制劑存在下NPs的內(nèi)化（圖4i-k和擴展數(shù)據(jù)圖8h-m）。結(jié)果表明，膽固醇和肌動蛋白驅(qū)動的機制有助于增強對高膽固醇血清中形成的冠-納米顆粒復(fù)合物的攝取。由于攝取所需的細胞表面受體在PC介導(dǎo)的細胞攝取NPs中的既定作用，測試了低密度脂蛋白受體(LDLR)和B型清道夫受體1型(SR-B1)是否參與。在競爭測定中，細胞預(yù)先與LDL和HDL預(yù)孵育以阻斷LDLR和SR-B1，并使用牛血清白蛋白(BSA)孵育作為對照。盡管預(yù)孵育在一定程度上抑制了SNPs-Nor-PC和SNPs-Cho-PC的攝取，但只有LDL和HDL對SNPs-Cho-PC的攝取具有比對SNPs-Nor-PC更明顯的抑制作用（圖4l）。因此，LDLR和SR-B1可能參與脂蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化增強。

圖4|Cho-PC增強了肝細胞中

NPs的細胞內(nèi)化

5、高膽固醇血癥小鼠體內(nèi)納米顆粒的生物分布

Cho-PC是否可以改變NP的體內(nèi)生物分布，通過高膽固醇飲食喂養(yǎng)小鼠15周建立高膽固醇血癥小鼠模型（圖5a）。詳細分析發(fā)現(xiàn)，與FBS和人血清中的結(jié)果相比，PC的蛋白質(zhì)組成發(fā)生了類似的變化（圖5c、d和擴展數(shù)據(jù)圖9）。因此，血清膽固醇差異水平對PC制劑的調(diào)節(jié)也可以在小鼠高膽固醇血癥模型中重現(xiàn)，與人血清結(jié)果一致。接下來，比較了從正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠收集的血液和組織中AuNP的體內(nèi)生物分布（擴展數(shù)據(jù)圖10a、b）。1小時后，在高膽固醇血癥小鼠中觀察到肝臟中鋅和銅水平增加。當(dāng)24小時時，肝臟中的差異消失，但睪丸、腸、腎和脾中出現(xiàn)差異，這表明某些金屬元素的分布可能受到健康狀態(tài)依賴性靜脈注射納米藥物方式的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)對健康和高膽固醇血癥個體進行靜脈注射時，基于納米粒子的納米藥物可能會出現(xiàn)不同的體內(nèi)命運，例如生物相容性和生物分布，這為精密納米醫(yī)學(xué)提供了重要的見解（圖6）。用熒光標(biāo)記的衍生物測量了SNP的體內(nèi)分布，結(jié)果表明，高膽固醇血癥會影響納米粒子的體內(nèi)生物分布。

圖5|正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠

中納米顆粒的體內(nèi)生物分布

圖6|NP在健康和高膽固醇血癥

個體中的命運

結(jié) 論

本研究建立了一個FBS系統(tǒng)來研究膽固醇對PC形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)高水平的膽固醇會增強載脂蛋白的保留，并減少PC中的補體蛋白。從小鼠和人類制備的高膽固醇血癥血清和正常血清驗證了結(jié)果。但值得注意的是，在血清這樣的復(fù)雜環(huán)境中，載脂蛋白和補體蛋白的動態(tài)變化也可能影響PC的形成。本研究揭示了Cho-PC對NP體外和體內(nèi)行為的影響。Cho-PC引發(fā)巨噬細胞對NP更強的免疫反應(yīng)。使用HepG2細胞作為人肝細胞的體外模型研究了NP的細胞攝取，發(fā)現(xiàn)Cho-PC促進HepG2細胞中納米粒子的細胞攝取，詳細分析表明，增強的內(nèi)化是由細胞表面的SR-B1和LDLR以及細胞內(nèi)部的肌動蛋白驅(qū)動機制介導(dǎo)的。高膽固醇血癥中形成的Cho-PC確實改變了NP的體內(nèi)生物分布。對于金納米粒子等金屬納米粒子，它們可能與體內(nèi)的必需元素相互作用，導(dǎo)致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)和不良生物效應(yīng)。納米藥物的安全性應(yīng)該以健康狀態(tài)依賴的方式進行評估，納米顆粒將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，形成的PC也可能受到周圍代謝環(huán)境的影響。

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