一、 HRP 辣根過氧化酶是常見的酶促發光或顯色的交聯酶，由于HRP比活高、特異性更強、分子量小（40kD）、穩定性好和作用底物范圍廣的優點而得到廣泛使用。HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學發光底物和生色底物2大類:

1. 化學發光底物：

化學發光底物主要考慮的是：發光信號強弱——發光信號當然越強越好，強發光信號持續的時間也是越長越好，還有就是背景低靈敏度高。

原理：試劑中的發光物在辣根過氧化物酶的作用下發生氧化降解，并發射波長為428nm的光，此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

常用的化學發光底物有ECL，在ECL底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP的作用下，發出熒光來。

索萊寶ECL Plus

產品簡介:索萊寶ECL Plus熒光檢測試劑采用*的發光底物系統，具有靈敏度和高信噪比，可檢測出10-100 fg的微量抗原，檢測靈敏度高出普通ECL產品100倍以上；同時該試劑極其節省抗體(一抗1:2000-1:6000，二抗1:4000-1:10000)，產生的非特異背景非常低。發光迅速，熒光可使X感光膠片感光達12小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測。

產品組成：以100ml規格為例，含50 ml 溶液A和50 ml 溶液B。根據用量，使用前混合。用途：用于HRP標記抗體的Western Blot和HRP標記探針的核酸雜交。

安全性：無特殊毒性，按普通化學品處理。

產品儲存：4 ºC避光儲存1年。25 ºC室溫放置數周不影響質量。

同時索萊寶還擁有多種ECL化學發光檢測試劑盒，更大程度的方便了客戶的實驗過程。

索萊寶ECL化學發光試劑盒

產品內容：
1. 封閉試劑： 30g(可配制 400ml)。
2. 10 倍濃縮抗體稀釋液50ml。
3. HRP 標記二抗0.3ml，效價 1： 500-1000。
4. ECL 顯色液，25mlA+25mlB。
產品保存：-20℃避光密閉保存，一年有效。若經常使用，可將封閉試劑，抗體稀釋液和 ECL 顯色液存放于 2-8℃以方便使用。

HRP的生色底物顯色有DAB， AEC和TMB等（而得到可溶性產物的底物如OPD，ABTS等則適用于ELISA）中，與化學發光法中的酶促基團發光不同，底物顯色主要是利用底物在有HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化積累，這一過程檢測WB的結果。

HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。

• DAB(3.3－二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性產物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現配現用，顯色后光照數小時會褪色，不能*保存，需要拍照記錄，而且有毒。

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• 目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色。

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TMB雙組分是將A、B液分開放置，現用現混；TMB單組分則將A、B液預先混合在一起，直接使用。其TMB雙組分顯色液有50*2、100*2、250*2、500*2四個規格，可根據不同實驗的需求選擇不同規格產品。

• 另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB因致癌可能性較小，因此皆是值得被優選的供氫體。

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堿性磷酸酶AP：

Western Blot檢測系統中常用交聯酶兩大家族中的另外一類就是AP——堿性磷酸酶。由于AP實驗經常會遇到膜上顯色背景偏高的問題，所以就WesternBlot本身來說偏愛HRP的要比AP多。AP顯色底物生成的產物主要是藍紫色，成像性好，容易拍照。早些年前，AP檢測的靈敏度比HRP高，整個顯色過程更有“技術性”，有許多個人技巧在里面，讓人取舍兩難。如今由于HRP的化學發光底物已經不斷改進而使得靈敏度不斷提高，化學發光顯色上HRP和AP不相上下，但是生色反應來說，AP顯色的靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。

AP常用的檢測底物常用的是BCIP ，NBT 和INT。為了達到更好的效果我們經常會將其結合使用

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