Cell Counting Kit-8

產品簡介：     Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。可用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗

使用說明：

一、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。 

2、按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3、接種后培養細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養一定時間后測定OD 值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X 軸），OD 值為縱坐標（Y 軸）的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養時間。）

二、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在37℃,5% CO2的條件下）。 

2、向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。 

3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。 

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。 

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

三、細胞增值-毒性檢測

1、在96孔板中配置100 μL 的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時（在37 ℃，5% CO2的條件下）。 

2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24或48小時）。

3、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。

4、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

5、用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

6、如果暫時不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

活力計算：.

細胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0加藥)－A(空白)]×100 

A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 

A（空白）：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度 

A（0 加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 

細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項： 

①建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。 

②白細胞可能需要培養較長時間。 

③當使用標準96 孔板時，貼壁細胞的小接種量少為1 ,000個/孔 (100 μL培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 ( 100 μL培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10% 加入CCK-8溶液。 

④如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm檢測靈敏度高。 

⑤培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。