植物氨態氮含量
檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC1525
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前將試劑三倒入使其充分溶解備用。該試劑溶解后10天內有效。

2. 試劑二：臨用前加1 mL蒸餾水充分溶解。

3. 標準品：10 mg半胱*酸，臨用前加入1.157 mL提取液，得到1000 μg/mL氮標準液。

產品說明：
氮素是構成生物體的一種必需元素。氨態氮進入植物細胞后形成氨基酸或酰胺，植物組織氨氮含量可反映植物受脅迫的程度。
氨基酸的α-氨基可與水合茚三酮反應，產生藍紫色化合物，在570nm有特征吸收峰；通過測定570nm吸光度，來計算氨基酸含量。
技術指標：
低檢出限：24.2 μg/mL
線性范圍：25-400 μg/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、無水乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，室溫勻漿后于25℃，12000g離心10min，取上清待測。
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至570nm，分光光度計蒸餾水調零。

2. 將1000μg/mL氮標準液用提取液分別稀釋為400、300、200、100、50、25 μg/mL。

3. 操作表：

充分混勻后蓋緊瓶蓋封口膜封口（防止水分散失），置于沸水浴中保溫10min，冷卻后反復顛倒EP管數次，將測定管8000rpm離心5min后取上清，吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中，于570nm測定吸光值。顯色后務必在30min內測完。計算ΔA=A測定管-A空白管，ΔA標準=A標準管-A空白管。
三、植物氨態氮含量計算

1. 標準曲線的繪制：

以各個氮標準液為橫坐標，其對應的ΔA標準為縱坐標，建立標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程中，得到x (μg/mL)。

1. NH₃-N含量的計算：

（1）按樣本質量計算：NH₃-N含量（μg/g 質量）=x×V提取÷W=x÷W
（2）按蛋白濃度計算：NH₃-N含量（μg/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）=x÷Cpr
W：樣本質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V提取：樣本提取液總體積，1mL。
注意事項：
為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。
相關發表文獻：
[1] Fuyuan Zhu,Moxian Chen,Wailung Chan,et al. SWATH-MS quantitative proteomic investigation of nitrogen starvation in Arabidopsis reveals new aspects of plant nitrogen stress responses. Journal of Proteomics. September 2018; (IF3.537)
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