線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ/細*色素C氧化酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0945
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：試劑放于試劑瓶內玻璃瓶中。臨用前取1支加入13.5mL試劑一溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

2. 試劑三：試劑置于試劑瓶內EP管中；臨用前取1支加入2mL試劑一溶解，用不完的試劑-20℃保存2周，避免反復凍融；

3. 工作液的配制：臨用前取0.5mL試劑三加入到溶解好的4.5mL試劑二中混合備用（約25T），或者按比例現用現配。

產品說明：
線粒體復合體Ⅳ又稱細*色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細*色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧生成水。還原型細*色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細*色素C生成氧化型細*色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數），使A1-A2小于0.2，可提高檢測靈敏度；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨測量）。

3. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應

4. 附：使用樣本重量計算公式：（檢測樣本數為100T/48S）

A、上清中復合體Ⅳ活力的計算：
單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=[ΔA上清×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清測定值；V反總：反應體系總體積，2.1×10^-4L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL；W：樣本重量，g；T：反應時間，1min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復合體Ⅳ活力的計算：
單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=[ΔA沉淀×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA沉淀÷W
ΔA沉淀：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，2.1×10^-4L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入提取液體積，0.4mL。W：樣本重量，g。T：反應時間，1min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復合體Ⅳ總活力的計算：
樣本復合體Ⅳ總活力即為上清中復合體Ⅳ活力與沉淀中復合體Ⅳ活力之和。
按樣本質量計算：復合體Ⅳ（U/g 質量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
D、按96孔板計算：
將上述計算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
實驗實例：

1. 取0.1g兔肝臟進行樣本處理，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿ΔA2=A1空白管-A2空白管=0.7713-0.7669=0.0044，上清液的ΔA1=A1測定管-A2測定管=0.7985-0.7754=0.0231，ΔA上清=ΔA1-ΔA2=0.0231-0.0044=0.0187，沉淀中的ΔA1=A1測定管-A2測定管=0.8843-0.7415=0.1428，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA2=0.1428-0..0044=0.1384，按樣本質量計算：

上清液中復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=1099×ΔA上清÷W=1099×0.0187÷0.1=205.513 U/g 質量
沉淀中復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=440×ΔA沉淀÷W=440×0.1384÷0.1 =608.96 U/g 質量
則樣本復合體Ⅳ總活力（U/g 質量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
=1099×0.0187÷0.1+440×0.1384÷0.1=814.473 U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

2. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018;(IF8.274)

3. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

1. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

2. Li N, Qin S, Xie L, et al. Elevated Serum Potassium Concentration Alleviates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via Mitochondrial Preservation[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(4): 1664-1674.

參考文獻：

1. Willis J H, Capaldi R A, Huigsloot M, et al. Isolated deficiencies of OXPHOS complexes I and IV are identified accurately and quickly by simple enzyme activity immunocapture assays[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2009, 1787(5): 533-538.

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