磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC0535
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二A：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑二B：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑二C：臨用前取一支加入0.5mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑二D：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

5. 試劑三：臨用前根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為1μL:50μL（約5T）的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

6. 試劑四：臨用前根據(jù)用量按照試劑四:蒸餾水為1μL:125μL（約12T）的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

7. 工作液的配制：根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二A：試劑二B：試劑二C：試劑二D =8mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL（約55T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-二磷酸和ADP，丙 酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項：

1. 測定過程中試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4. 不同勻漿組織中PFK活性不一樣，若ΔA>0.5，則說明活性太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液，或縮短反應(yīng)時間至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高檢測的靈敏度。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1g黑麥草加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA=A1-A2=1.6086-1.2986=0.31，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PFK活性（U/g 質(zhì)量）=535×ΔA÷W=535×0.31÷0.1=1658.5 U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g桃葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA=A1-A2=1.7025-1.6159=0.0866，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PFK活性（U/g 質(zhì)量）=535×ΔA÷W=535×0.057÷0.1=463.31 U/g 質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)：

1. Papagianni M, Avramidis N. Lactococcus lactis as a cell factory: a twofold increase in phosphofructokinase activity results in a proportional increase in specific rates of glucose uptake and lactate formation[J]. Enzyme and microbial technology, 2011, 49(2): 197-202.

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