4-香豆酸：輔*A連接酶（4CL）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
貨號(hào): BC4225
規(guī)格: 100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻；

2. 試劑二：臨用前加入3 mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：臨用前用4 mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑五：加入1 mL乙醇溶解，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5. 工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
4-香豆酸：輔*A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔*A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下測(cè)有特征吸收峰，測(cè)定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 若ΔA大于0.5，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2. 建議一次測(cè)定不要測(cè)定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間。

3. 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過0.01。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g芥菜加1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用微量石英比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定管-A1測(cè)定管=0.7425-0.5851=0.1574，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1574，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：4CL（U/g 質(zhì)量）=476.19×ΔA÷W=476.19×0.1574÷0.1=749.52 U/g 質(zhì)量。

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