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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC3350-50T/24S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：898
010-50973130
產品分類
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紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3350
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×3支 | -20℃保存 |
試劑六 | 粉劑×3支 | -20℃保存 |
試劑七 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入1.25 mL蒸餾水，充分混勻；2-8℃保存2個月；
2、 試劑三：臨用前加入1.25 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
3、 試劑四：臨用前加入1.25mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
4、 試劑五：臨用前每支加入1 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
5、 試劑六：臨用前每支加入1 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
6、 試劑七：臨用前加入4 mL蒸餾水，充分混勻后-20分裝保存4周，避免反復凍融；
7、 工作液的配制：臨用前根據實驗所需用量，按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四 =740μL: 20μL: 20μL: 20μL（1T的量）的比例，充分混勻，現用現配。
產品說明：
糖原磷酸化酶是糖原分解代謝中的關鍵酶，催化糖原的磷酸化反應。該酶分為有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b, GPb）兩種形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶a的催化下進行。未添加激活劑時，糖原磷酸化酶a催化糖原和無機磷產生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。添加激活劑測定GP（GPa和GPb）總活性，未添加激活劑時測定GPa活性，GP活性-GPa活性得到GPb活性。在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、恒溫培養箱/水浴鍋、電子天平、可調式移液器、研缽/勻漿器、1 mL石英比色皿、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
2、血清（漿）：直接檢測。若有渾濁可以離心后取上清進行測定。
3、細菌或者細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內，棄上清，按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30 min以上，調節波長至340 nm，蒸餾水調零。
2、 工作液置于37℃預熱5min。
3、 GPa活性：在石英比色皿中依次加入50 μL樣本、50 μL試劑五、50 μL試劑六、50 μL蒸餾水、800 μL工作液，立即混勻并計時，記錄340nm處10s時吸光值A1，37℃水浴鍋或者恒溫培養箱反應10min，反應后拿出迅速擦干測定10min10s時吸光值A2。計算ΔAGPa=A2-A1。
4、 GP活性：在石英比色皿中依次加入50 μL樣本、50 μL試劑五、50 μL試劑六、50 μL試劑七、800 μL工作液，立即混勻并計時，記錄340nm處10s時吸光值A3，37℃水浴鍋或者恒溫培養箱反應10min，反應后拿出迅速擦干測定10min10s時吸光值A4計算ΔAGP=A4-A3。
三、 糖原磷酸化酶b (GPb)活性計算
1. 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GPb（U/mg prot）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷Cpr
2. 按樣本質量計算
單位定義：每g組織每分鐘產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GPb（U/g 質量）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷W
3. 按樣本體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘產生1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位
GPa（U/mL）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V反總÷(ε×d)×109] ÷V樣÷T=321.54× (ΔAGP-ΔAGPa)
4. 按細胞數量計算
單位定義：每1萬個細胞每分鐘產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GPa（U/104 cell）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V反總÷(ε×d)×109] ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa)÷細胞數量
V反總：反應體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；細胞數量：以萬計；109：1mol=109nmol。
注意事項：
1、如果測定吸光值ΔA＞0.8，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加反應中的樣本體積或者樣本質量后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。按照測定步驟操作，用石英比色皿比色后計算ΔAGPa=A2-A1=0.414-0.318=0.096，ΔAGP=A4-A3= 0.434-0.320 =0.114,按公式計算活性：
GPb（U/g 質量）=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷W =321.54×(0.114-0.096)÷0.1 =57.87U/g 質量
糖原磷酸化酶b（GPb）檢測試劑盒 糖原 糖原磷酸化酶b（GPb）檢測試劑盒 糖原
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