丙酮酸（PA）含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2205

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 標準品：20μmol/mL丙酮酸鈉標準溶液。

2、 0.125μmol/mL標準溶液的配制：取50μL 20μmol/mL 標準液和450μL蒸餾水混勻，即2μmol/mL 標準液；再取50μL 2μmol/mL 標準液和750μL蒸餾水混勻即配成0.125μmol/mL標準溶液。

產品說明：

丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

丙酮酸與2,4-二硝*肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝*腙，在堿性溶液中呈櫻紅色。

技術指標：

低檢出限：0.001 μmol/mL

線性范圍：0.0015-0.25 μmol/mL

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎（冰浴，200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），靜置30min，8000g，常溫離心10min，取上清待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，常溫離心10min，取上清待測。

3、血清（漿）樣本等液體：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取0.1mL液體樣本加入1mL 提取液），進行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，常溫離心10min，取上清待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至520nm，分光光度計蒸餾水調零。

2、 操作表：（在1.5mL EP管或者96孔板中加入下列試劑）

三、丙酮酸含量計算

1、按照血清（漿）體積計算

丙酮酸含量（μmol/mL）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×（V提取+V液體）÷V液體 = 0.1375×ΔA測定÷ΔA標準

2、按照樣本蛋白濃度計算

丙酮酸含量（μmol /mg prot）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷(V提取×Cpr) =0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

3、按照樣本質量計算

丙酮酸含量（μmol /g 質量）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷W=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W

4、按照細菌或細胞數量計算

丙酮酸含量（μmol /10⁴ cell）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷N=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷N

C標準：0.125μmol/mL 標準溶液；V提取：加入提取液體積，1mL；V液體：加入血清（漿）等液體體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以萬計。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

2. 提取液中含有蛋白變性成分，若使用蛋白濃度計算需要另取組樣本提取測定。

實驗實例：

1. 稱取約0.1171g兔肝，加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，常溫離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.544-0.085=0.459，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.436-0.085 =0.351，計算丙酮酸含量得：PA（μmol/g 質量）=0.125 ×ΔA測定÷ΔA標準÷W =1.396 μmol/g 質量

2. 稱取約0.1094g合歡，加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，常溫離心10min，取上清用蒸餾水稀釋2倍后待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.552- 0.085=0.467，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.436-0.085 =0.351，計算丙酮酸含量得：

PA（μmol/g 質量）=0.125 ×ΔA測定÷ΔA標準÷W ×稀釋倍數=3.040 μmol/g 質量

3. 取50μL兔血清之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A空白管=0.125-0.085=0.040，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.436-0.085 =0.351，計算丙酮酸含量得：PA（μmol/mL）=0.1375 ×ΔA測定÷ΔA標準 =0.016 μmol/mL

相關發表文獻：

[1] Yao R, Yang Y, Lian S, et al. Effects of acute cold stress on liver O-GlcNAcylation and glycometabolism in mice[J]. International journal of molecular sciences, 2018, 19(9): 2815.

[2] Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al. Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

[3] Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6):2715-2729.(IF3.67)

[4] Luo M,Luo Y, Mao N,et al. Cancer-Associated Fibroblasts Accelerate Malignant Progression of Non-Small Cell Lung Cancer via Connexin 43-Formed Unidirectional Gap Junctional Intercellular Communication. Cellular Physiology and Biochemistry. November 2018

參考文獻：

[1] Venkatesh C, Ramalingam K. Lactic acid, pyruvic acid and lactate/pyruvate ratio in the Anoplocephalid tapeworm Stilesia globipunctata infecting sheep (Ovis aries)[J]. Veterinary parasitology, 2007, 144(1-2): 176-179.

[2] Randle W M, Bussard M L, Warnock D F. Ontogeny and Sulfur Fertility Affect Leaf Sulfur in Short-day Onions [J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1993, 118(6): 762-765.

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