細胞壁結合酸性轉化酶（CWI）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4325

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入20 mL試劑一，充分溶解后待用；

2、 標準品：10 mg無水*萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存一周。

產品說明：

蔗糖轉化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代謝中發揮著重要作用。Inv根據最適pH，可分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI），其中AI根據亞細胞定位的差異又可分為可溶性酸性轉化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和細胞壁結合酸性轉化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以離子鍵的形式結合在細胞壁上，在“庫"組織韌皮部蔗糖卸載、蔗糖質外運輸、植物的生長發育以及抵抗各種脅迫中起著重要作用。

CWI催化蔗糖降解產生還原糖，還原糖與3,5 –二硝基水楊酸反應生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質，通過測定540nm處吸光值變化可計算得CWI活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式低溫離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸餾水，充分震蕩混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混勻，4℃浸提15h，4℃，12000g，離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。

2、 將10mg/mL標準液用蒸餾水稀釋為2、1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的標準溶液備用。

3、 操作表 (在1.5mL離心管中操作) ：

注意：如果樣本在37℃反應后的95℃水浴步驟中出現沉淀，建議室溫12000g，離心5min，取上清（若上清不足400µL，可按比例縮小加樣體系，如300µL上清+150µL試劑三）進行下一步操作。

三、CWI活性計算

1、 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。

2、 CWI活性的計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：37℃每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產生1µg還原糖為1個酶活力單位。

CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T = 33.33x÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義：37℃每g樣本每分鐘分解蔗糖產生1µg還原糖為1個酶活力單位。

CWI酶活（U/g質量）= x×V提取×10³÷W÷T = 33.33x÷W

V提取：提取液二體積，1mL；10³：單位換算系數，1mg = 10³µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min。

注意事項：

1. 當A或ΔA超過1.5時，建議將樣本用提取液二稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。

2. 95℃水浴時EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實驗后冷卻時間保持一致），再進行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗數據。

實驗實例：

1. 取0.1g丁香葉加入1mL提取液進行勻漿研磨，最后取上清后按照操作步驟操作，用96孔板測得A對照管=0.358，A測定管=0.566，標準曲線y=0.8552x-0.1864，A空白管=0.068，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.566-0.358=0.208，x=（0.208+0.1864）÷0.8552=0.461，按樣本質量計算酶活得：

CWI酶活（U/g質量）=33.33x÷W=33.33×0.461÷0.1= 153.711 U/g質量。

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