丙酮酸脫羧酶（PDC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC1075

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻。

2、 試劑一的配制：臨用前配制，將試劑一B、試劑一C加入到試劑一A中并充分溶解。-20℃分裝保存，可保存1個月，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑二B：臨用前加入0.3mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

4、 試劑二C：臨用前加入1mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

5、 試劑二的配制：臨用前配制，取1.305mL試劑二A、0.12mL試劑二B、0.075mL試劑二C混合（共1.5mL，約75T），現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進(jìn)一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340nm有吸收峰，而NAD⁺沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品

臺式離心機(jī)、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/ 96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。16000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織樣本：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣本：直接檢測。

二、操作步驟

1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、 根據(jù)樣本數(shù)取適量試劑一、試劑三37℃提前預(yù)熱30min.

3、 操作表：（在微量石英比色皿/ 96孔UV板中按下表順序加入試劑）

迅速混勻后于340nm比色，記錄10s和70s的吸光值，測定管的記為A1和A2，空白管的記為A3和A4，計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做1-2次）

三、PDC活性計算

A.使用微量石英比色皿測定的計算：

1、血清（漿）PDC活力的計算：

單位定義：在37℃條件下，每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/mL）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷V樣本÷T=1.61×ΔA

2、 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：在37℃條件下，每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/mg prot）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷(V樣本×Cpr)÷T=1.61×ΔA÷Cpr

3、 按樣本質(zhì)量計算：

單位定義：在37℃條件下，每g組織質(zhì)量在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷ (W÷V提取×V樣本)÷T=1.61×ΔA÷W

4、 細(xì)菌或細(xì)胞中PDC活力的計算：

單位的定義：在37℃條件下，每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol的NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/10⁴ Cell）= ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷(V樣本÷V提取×N)÷T =1.61×ΔA÷N

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣本：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定；T：反應(yīng)時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；V提取：提取液體積，1mL；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以萬計；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=10⁶μmol。

B.使用96孔UV板測定的計算：

1、血清（漿）PDC活力的計算：

單位定義：在37℃條件下，每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/mL）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷V樣本÷T=2.68×ΔA

2、按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：在37℃條件下，每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/mg prot）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷(V樣本×Cpr)÷T=2.68×ΔA÷Cpr

3、按樣本質(zhì)量計算：

單位定義：在37℃條件下，每g組織質(zhì)量在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷ (W÷V提取×V樣本)÷T=2.68×ΔA÷W

4、細(xì)菌或細(xì)胞中PDC活力的計算：

單位定義：在37℃條件下，每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol的NADH氧化定義為一個酶活力單位。

PDC（U/10⁴ Cell）= ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁶÷(V樣本÷V提取×N)÷T =2.68×ΔA÷N

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣本：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定；T：反應(yīng)時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；V提取：提取液體積，1mL；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以萬計；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=10⁶μmol。

注意事項(xiàng)：

1、 實(shí)驗(yàn)時，試劑二和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，可以取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中；或者使用浮漂固定比色皿放入水浴鍋；或者使用恒溫培養(yǎng)箱等。

3、 最好兩個人同時做此實(shí)驗(yàn)，一個人比色，一個人計時，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用96孔板測定時不推薦同時測多個樣本。

4、 如果1分鐘變化值較小可延長反應(yīng)時間，同時注意修改計算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g綠蘿葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.9557-0.9299）-（0.7363-0.7301）=0.0196，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PDC（U/g 質(zhì)量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.0196÷0.1=0.3136 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋40倍后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.703-0.468）-（0.7363-0.7301）=0.2288，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PDC（U/g 質(zhì)量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.2288÷0.1×40（稀釋倍數(shù)）=146.432 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1] Chong Li,Shi Gao,Xiaotong Li,et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018;(IF5.452)

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