土壤植酸酶活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5375

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：甲苯，需自備。

2. 試劑二：臨用前將試劑二B全部倒入試劑二A中，充分震蕩溶解，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

3. 試劑三：臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.81mL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

4. 試劑四：臨用前加入13mL蒸餾水充分溶解，再加入20μL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

5. 工作液：臨用前根據測定數量將試劑三：試劑四=1mL：5mL（約60T，可根據樣本量按比例調整）的比例混勻，配制后于2-8℃可保存3天。

6. 標準品：10μmol/mL無機磷標準液。

產品說明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一種蛋白質和糖的結合酶，植酸酶可以分解植酸產生無機磷和肌醇，極大的提高生物對養分的利用率。土壤植酸酶主要來自于土壤中的微生物，在磷素循環中起著重要作用，土壤植酸酶在土壤改良和農業可持續發展領域具有較強的應用前景。

在一定的環境條件下，土壤植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產生無機磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無機磷和鉬酸銨顯色劑發生反應，產生藍色的鉬藍物質，其在700nm有特征吸收峰，通過測定無機磷的含量，可計算出土壤植酸酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

酶標儀/可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、研缽、30-50目篩、甲苯、濃硫酸、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣自然風干或 37℃烘箱風干，過 30~50 目篩。

二、測定步驟

1、酶標儀/可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至700nm?？梢姺止夤舛扔嬘谜麴s水調零。

2、標準溶液的稀釋：將10μmol/mL無機磷標準液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.039、0.02、0.01μmol/mL備用。

3、標準溶液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標準管需100µL標準溶液。

4、在離心管中按下表步驟加樣：

     室溫靜置15min，于700nm處測定吸光值，分別記為A測定、A對照、A標準、A空白。分別計算 ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白（標準曲線和空白管只需做 1-2 次，每個測定管需設置一個對照管）。

三、土壤植酸酶活性的計算

1. 標準曲線的繪制

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）代入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 土壤植酸酶活性計算

單位定義：37℃下每g土壤每天在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。

土壤植酸酶活性（U/g）= x×V反總÷W÷T=0.52x÷W

V反：反應體系總體積，0.52mL；W：土壤質量，g；T：反應時間，24h=1d。

注意事項：

1. 為防止沸水浴10min過程中水分散失，建議使用螺旋蓋的離心管或用封口膜給EP管纏口。

2. 如果ΔA測定< 0.01，適當延長第一步37℃反應時間或加大樣本量后，重新測定。如果ΔA測定＞1.2，建議將上清液用蒸餾水適當稀釋后進行測定，注意乘以稀釋倍數。

3. 結果于30min內測定完畢，盡量保證所有樣本測定時間的一致性。

實驗實例：

1.   取0.03g三葉草土壤，按照測定步驟操作，在96孔板中測得A測定 = 0.359，A對照 = 0.28，?A測定= 0.079，將?A代入標曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.0642，按樣本質量計算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.113 U/g。

2.   取0.03g蘑菇土土壤，按照測定步驟操作，在96孔板中測得A測定 = 0.442，A對照 = 0.32，?A測定= 0.122，將?A代入標曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.1029，按樣本質量計算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.784 U/g。

參考文獻：

[1] Berry D F, Shang C, Zelazny L W. Measurement of phytase activity in soil using a chromophoric tethered phytic acid probe[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2009, 41(2):192-200.

[2] Marshall, Arebojie, Azeke, et al. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum) [J]. Journal of Food Science & Technology, 2011, 48(6):724-729.

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