亞鐵離子含量檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5415

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg FeSO₄·7H₂O，臨用前加入900μL蒸餾水和20μL濃硫酸，充分混勻，配制成40 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃可保存2周。

產(chǎn)品說明：

鐵是人體必需的微量元素之一，對(duì)于維持機(jī)體正常生理功能具有重要作用。亞鐵離子是血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素及其他酶系統(tǒng)的重要組成成分，幫助氧的運(yùn)輸，促進(jìn)脂肪氧化。缺乏鐵元素容易造成貧血、代謝紊亂，并影響機(jī)體的免疫功能。鐵過量是引發(fā)或加劇多種慢性病（如糖尿病、心腦血管疾病、神經(jīng)退化性疾病等）的危險(xiǎn)因素。Fe²⁺在酸性條件下與三吡啶基三嗪形成藍(lán)色配合物，在593nm處有吸收峰，通過測(cè)定該波長吸光度即可計(jì)算Fe²⁺的含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、冰、蒸餾水和濃硫酸。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間5min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。若有渾濁請(qǐng)離心后取上清待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至593nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取10μL 40 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，加入990μL蒸餾水，混勻得到400 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，將400 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液用試劑一進(jìn)行稀釋得到50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需200µL標(biāo)準(zhǔn)液。

4. 在1.5mL離心管中按下表步驟加樣：

三、亞鐵離子含量計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/L）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/L）。

2. 亞鐵離子含量的計(jì)算：

（1）按血清（漿）等液體體積計(jì)算：亞鐵離子含量（μmol/L）=x

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：亞鐵離子含量（μmol/mg prot）=x×10^-3×V提取÷（Cpr×V提取）=0.001x÷Cpr

（3）按樣本質(zhì)量計(jì)算：亞鐵離子含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×10^-3×V提取÷W=0.001x÷W

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：亞鐵離子含量(μmol/10⁶ cell)=x×10^-3×V提取÷N= 0.001x÷N

Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V提取：加入試劑一的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)；10^-3：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol/L=10^-3μmol/mL。

注意事項(xiàng)：

1. 用試劑一稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)液容易失效，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 如果?A測(cè)定過低或測(cè)定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定；如果?A測(cè)定大于0.4，建議將樣本用試劑一適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

3. 由于氯仿會(huì)腐蝕96孔板，所以在吸取上層無機(jī)相時(shí)需要注意不要吸到下層氯仿層。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1055g 小鼠肝臟組織，加入1mL試劑一，冰浴勻漿，離心后取上清按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.272-0.050=0.222，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0076x-0.0013，R²=0.9993，計(jì)算x=29.38μmol/L，按樣本質(zhì)量計(jì)算： 

亞鐵離子含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.001x÷W =0.278 μmol/g 質(zhì)量。

2、 取200μL牛血清，按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.301-0.050=0.251，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0076x-0.0013，計(jì)算x=33.20μmol/L，按液體體積計(jì)算：

亞鐵離子含量（μmol/L）=x=33.20 μmol/L。

參考文獻(xiàn)：

[1] Dong C, Yang M, Wang W. Study on spectrophotometric determination of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) with 2, 4, 6- tri(2′-pyridyl)-1, 3, 5-triazine. [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2004, (01):76-78.

[2] Huang Y, Ma H, Xu J, et al. Development and Validation of Reference Methods for Determination of Serum iron. [J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2011, 15(03):453-457.

[3] Wang H, Liu B, Ding Z, et al. Ferene method flow injection analysis as optimized in situ analysis of dissolved iron in marine waters. [J]. Marine Sciences, 2016, 40(05):82-87.

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