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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5040-50T/24S
更新時間：2024-07-07
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：770
010-50973130
產品分類
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α-甘露糖苷酶(α-man)活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5040
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前每支加入1mL 試劑四溶解，溶解后的試劑在-20℃分裝保存，可以保存4周。
2、 標準品：5mmol/L的對硝 基苯*標準液。
產品說明：
α-man分布廣泛、種類繁多，在真核生物胞質、內質網、高爾基體、溶酶體中都有發現，不同種類、功能的α-man共同參與N-聚糖的修飾過程。
α-man和特定底物發生反應，其生成物在405nm處有特征吸收峰，根據吸光度的變化率可計算出α-man活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、恒溫培養箱/水浴鍋、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、勻漿器/研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后12000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
2、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；按照細胞或細菌數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液）進行提取，冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后12000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。若有渾濁可以離心后測定
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至405 nm，蒸餾水調零。
2、 將5mmol/L的對硝基 苯*標準液用蒸餾水稀釋為0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的標準溶液備用。
3、 操作表：(在1.5 mL離心管中)
試劑名稱（µL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 125 | 125 | - | - |
標準溶液 | - | - | 125 | - |
試劑一 | 550 | 625 | 625 | 625 |
試劑二 | 75 | - | - | - |
蒸餾水 | - | - | - | 125 |
混勻，37℃水浴或恒溫培養箱中準確反應10 min | ||||
試劑三 | 250 | 250 | 250 | 250 |
混勻，測定405 nm處吸光值A，分別記為A測定管、A對照管、A標準管、A空白管。計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管，標準曲線、空白管只需檢測1-2次。 | ||||
三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性計算
1、 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y＝kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mmol/L，即μmol/mL）。
2、 α-甘露糖苷酶活性的計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘產生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）= x× V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr ×F
（2）按樣本質量計算
酶活定義：每g樣本每分鐘產生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/g質量）= x× V樣÷（W×V樣÷V提取）÷T×F= x×0.1÷W×F
（3）按照細胞或細菌數量計算
酶活定義：每104個細胞每分鐘產生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/104 cell）= x× V樣÷（細胞數量×V樣÷V提取）÷細胞數量（萬個）÷T×F
= x×0.1÷ 細胞數量（萬個）×F
（4）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘產生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V樣÷V樣÷T×F= x×0.1×F
V提取：提取液體積，1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.125 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，10 min； F：稀釋倍數。
注意事項：
1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL玻璃比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.404-0.309=0.095，標準曲線y=2.0294x+ 0.0092，計算x=0.0422，按公式計算活性：
α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質量）= x×0.1÷W×F = 0.0422U/g質量
2、 稱取0.1 g草莓果肉，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL玻璃比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.113-0.091=0.022，標準曲線y=2.0294x+ 0.0092，計算x=0.0063，按公式計算活性：
α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質量）= x×0.1÷W×F = 0.0063 U/g質量
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