TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL成為了檢測DNA段化（細胞凋亡）的常用方法。（以下是TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光））
二、TUNEL實驗中關鍵步驟
1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻；
2.把握好細胞通透的時間。一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內。
3.適當延長 TUNEL 反應液的時間。一般是37ºC 1 h，你也可以根據你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長 2 h，但要結合你終的背景著色。
4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應10 min 左右，結合鏡下控制背景顏色，長不超過 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利于辨認棕褐色，我不太喜歡。
5.PBS 的充分清洗。我個人認為，在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格，可增加次數達 5 次，因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色。
6. 此外，內源性 POD 的封閉也十分關鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響終的特異性染色。
三、細胞通透的時間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應試劑充分進入細胞核進行反應，提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片，只要不脫片，好像影響不大，其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 個月應該沒問題的（重復拿的那支），而一直冷凍的少可以用半年以上。
3. 蛋白酶K反應時間一般為10-30 min，具體時間長短與切片厚薄有關，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，終通過摸索時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。
關鍵試劑操作條件
DAB 顯色反應大約需要10 min，要控制好反應時間，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。
蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內摸索，溫度過高，時間過長，易破壞核酸結構，出現假陽性。
DNase 1 一般室溫，10 min 即可。
四、如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟，因富含內源性過氧化物酶，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色。
Tips
1.濕盒用帶蓋方盤，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時稍加水即可。
2.英文說明書中對組織細胞通透這一步中，加了“對難處理的組織的處理”，意思是用常規方法處理（如蛋白酶 K)后，應該陽性而做不出陽性時，可用微波修復。
3.復染的目的是為了襯托組織形態結構，以利于結果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。
4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，現在有賣的，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便，也不貴。
5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。

參考文獻：
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《Knockdown of TLR4 attenuates high glucose-induced podocyte injury via the NALP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway》 作者:Yang Liu,Zhonggao Xu,Fuzhe Ma,Ye Jia,Guannan Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.743 PMID:30257355

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